Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/24068
Title: ผลของภาวะการเก็บรักษาโอโอไซต์สุกรต่อการสุก และการปฏิสนธินอกร่างกาย
Other Titles: Effets of porcine follicular oocyte storage conditions on maturation and fertilization in vitro
Authors: สรรเพชญ โสภณ
Advisors: มณีวรรณ กมลพัฒนะ
วิทยา ยศยิ่งยวด
Other author: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. บัณฑิตวิทยาลัย
Issue Date: 2539
Publisher: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract: งานวิจัยนี้ มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลของอุณหภูมิที่มีต่อความสามารถในการเจริญของโอโอไซต์สุกรเพื่อปฏิสนธินอกร่างกายและความเป็นไปได้ในการแช่แข็ง โดยใช้โอโอไซต์ที่เจาะได้จากฟอลลิเคิลขนาด 2-6 มม. ของรังไข่สุกรจากโรงฆ่าสัตว์ และใช้มีเดียม M199B เป็นมีเดียมพื้นฐานในการเก็บและคัดเลือก โอโอไซต์ การเลี้ยงโอโอไซต์ให้สุก เลี้ยงใน IVM มีเดียม ซึ่งเป็นมีเดียม M199B ที่เสริม ฟอลลิเคิล สติมูเลติง ฮอร์โมน 1 หน่วย/มล. ลูทีไนซิง ฮอร์โมน 1 หน่วย/มล. เอสตราไดออล 1 ไมโครกรัม/มล. และของเหลวจากฟอลลิเคิล 10% โดยปริมาตร และได้นำไข่สุกมาได้ทำการปฏิสนธิกับน้ำเชื้อสดที่รีดจากพ่อสุกร ใน IVF มีเดียม ซึ่งเป็นมีเดียม M199B ที่เติม คาเฟอีน 2 มิลลิโมลาร์ ทั้งการเลี้ยงไข่ให้สุกและการปฏิสนธิกระทำในตู้บ่มอุณหภูมิ 39°ซ ในบรรยากาศที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ในอากาศ จากการศึกษาการเจริญของโอโอไซต์ที่เลี้ยงนาน 12-48 ช.ม. โดยตรวจดูทุก ๆ 2 ช.ม. พบว่าโอโอไซต์เจริญถึงระยะเมตาเฟส II ประมาณชั่วโมงที่ 32 และเริ่มมีเปอร์เซ็นต์การสุกสูง (80.5%) ตั้งแต่ชั่วโมงที่ 36 เป็นต้นไป และจากการทดสอบการปฏิสนธิของน้ำเชื้อจากพ่อพันธุ์สุกร 7 ตัว พบว่า น้ำเชื้อจากพ่อพันธุ์สุกรแต่ละตัวให้ผลการปฏิสนธิและการเจริญถึง 2-4 เซลล์แตกต่างกัน เมื่อศึกษาเปรียบเทียบการเจริญของโอโอไซต์ที่ได้จากรังไข่ที่เก็บไว้ที่ 24°ซ ก่อนนำมาเลี้ยงเป็นเวลา 0 8 12 18 หรือ 24 ช.ม. หลังจากนำรังไข่มาถึงห้องปฏิบัติการ พบว่าสามารถเก็บรังไข่ไว้ได้นาน 8 ช.ม. โดยมีเปอร์เซนต์ไข่สุกที่แตกต่างอย่างไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (P > 0.05) กับโอโอไซต์ที่ได้จากการเจาะรังไข่ทันทีที่มาถึงห้องปฏิบัติการ ในการทดสอบความเป็นพิษของสารป้องกันการเกิดเกล็ดน้ำแข็งภายในเซลล์ 5 ชนิด ได้แก่ กลีเซอโรล (GLY) ไดเมทิลซิลฟอกไซด์ (DMSO) เอทิลีนไกลคอล (EG) โปรปีลีนไกลคอล (PROH) บิวเทนไดออล (BUOH) พบว่า สารทุกชนิดที่ 1.5 โมลาร์ ไม่เป็นอันตรายต่อโอโอไซต์ที่จะเจริญจนสุก การทดลองลดอุณหภูมิของโอโอไซต์ลงจาก 29°ซ ถึง 4°ซ จะพบว่า เมื่ออุณหภูมิลดลงถึง 15°ซ เปอร์เซ็นต์ไข่สุกจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P < 0.001) และถ้าอุณหภูมิลดลงต่ำกว่า 15°ซ จนถึง 4°ซ จะไม่มีไข่สุกเลย ได้ทำการทดสอบความเป็นพิษของมีเดียม VTM 3 ชนิด สำหรับการทำไวตริฟิเคชัน คือ VTM 1 ประกอบด้วย EG 7.5 โมลาร์ ใน มีเดียม 199 ที่มี โบวายน์ซีรัมอัลบูมิน (BSA) 6% VTM 2 ประกอบด้วย EG 6.25 โมลาร์ และ GLY 0.7 โมลาร์ ซูโครส 0.1 โมลาร์ ในมีเดียม 199 ที่มี 20% ฟีตอลโบวายน์ซีรัม และ VTM 3 ประกอบด้วย EG 7.15 โมลาร์ ซูโครส 0.1 โมลาร์ และไซโตชลาซิน บี (CB) 1.75 ไมโครกรัม/มล. ในมีเดียม 199 ที่มี 20% ฟีตอลโบวายน์ซีรัม พบว่าการปรับสมดุลย์แรงดันออสโมติคในมีเดียม VTM ทุกชนิด ไม่มีผลทำให้โอโอไซต์สุกแตกต่างไปจากการเลี้ยงโอโอไซต์ให้สุกตามปกติอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ และเมื่อนำโอโอไซต์มาทำแช่แข็งด้วยวิธีไวตริฟิเคชัน พบว่าโอโอไซต์ที่ผ่านการแช่แข็งจากทุกมีเดียมไม่สามารถเจริญต่อหลังการละลาย เพราะเกิดการทำลายนิวเคลียสและโอโอเลมมา และการทดลองแช่แข็งไข่สุกพบว่าหลังการละลายไข่สุกไม่สามารถทำการปฏิสนธิได้และเกิดการทำลายนิวเคลียสและโอโอเลมมาด้วยเช่นกัน ซึ่งสามารถยืนยันได้จากภาพถ่ายจากกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนแบบทรานสมิชชัน การศึกษาครั้งนี้ทำให้สามารถใช้ประโยชน์จากรังไข่สุกรซึ่งมีอยู่มากให้เป็นประโยชน์ต่อการศึกษาวิจัยหาความรู้เกี่ยวกับการเจริญและพัฒนาของเซลล์ไข่ตลอดจนฝึกฝนหาประสบการณ์ในงานปฏิสนธินอกร่างกาย
Other Abstract: Porcine follicular oocytes obtained from ovaries collected from a slaughter house by aspirating the follicle 2-6 mm in diameter, M199B was used as basic medium for holding the oocytes. The oocytes were cultured in IVM medium which was M199B supplemented with follicle stimulating hormone 1 unit/ml, luteinizing hormone 1 unit/ml, oestradiol 1 microgram/ml and pig follicular fluid 10% v/v. Matured oocytes were fertilized, with sperm from fresh ejaculated semen obtained from boars, in IVF medium which was M199B supplemented with 2 mM caffeine. The oocytes were cultured and fertilized at 39 °C in 5% CO₂in air atmosphere. The oocytes were cultured for the period of 12-48 h and checked the maturation of nucleus every 2 h. The result showed that oocytes developed to metaphase II around 32th h and high maturation rate started form 36th h. The ability of semen from boars were tested. Results showed that there were difference among boars on fertilization ability and the development of fertilized oocytes to reach 2-4 cell stage. The ovaries were kept before oocytes collection at 24 °C for 0, 8, 12, 18 or 24 h starting from ovaries were arrived in the laboratory. Oocytes maturation were not significantly different (P > 0.05) between oocytes collected from 0 h or 8 h storage ovaries. Five cryoprotectants were tested for toxicity to the oocytes and it was found that glycerol (GLY), dimethylsulfoxide (DMSO), ethyleneglycol (EG), propyleneglycol (PROH) and butanediol (BUOH), at 1.5 M in M199B did not effect oocytes maturation. Effect of low temperature on oocytes maturation was tested by cooling the oocytes from 29 °C to 40 °C. Percentage of oocytes maturation was significantly decreased (P < 0.001) when cooling to 15 °C and beyond 15 °C to 40 °C the oocytes could not developed to metaphase II. Toxicity of 3 vitrification mediums (VTM), VTM 1 consisted of EG 7.5 M in medium 199 with 6% bovine serum albumin (BSA), VTM 2 consisted of EG 6.25 M, GLY 0.7 M sucrose 0.1 M and 20% feotal bovine serum (FBS) in medium 199 and VTM 3 consisted of EG 7.15 M, sucrose 0.1 M and Cyyochalacin B (CB) 7.5 microgram/ml in medium 199, were tested. The equilibrated oocytes in each VTM could mature nonsignificantly different from the unequilibrated oocytes. Cryopreservation oocytes by vitrification with each VTM could not protect the oocytes from damage. Vitrification of matured oocytes with each VTM resulted in unfertilized oocytes with damaged nucleuses after thawing. The photographs by transmission electron-microscope confirmed the damaging of oolemma in both frozen oocytes and matured oocytes. The information and knowledge from this study can be used as a base for further studying. The pig ovaries were easily collected and could be used as a mean for scientists to practice the cryopreservation of oocytes that related to IVM/IVF/IVC research.
Description: วิทยานิพนธ์ (วท.ด)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2539
Degree Name: วิทยาศาสตรดุษฎีบัณฑิต
Degree Level: ปริญญาเอก
Degree Discipline: วิทยาศาสตร์ชีวภาพ
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/24068
ISBN: 9746348752
Type: Thesis
Appears in Collections:Grad - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Sunpetch_so_front.pdf4.57 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_ch1.pdf1.36 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_ch2.pdf5.87 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_ch3.pdf6.92 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_ch4.pdf3.62 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_ch5.pdf3.91 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_ch6.pdf5.86 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_ch6.pdf5.86 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_ch7.pdf1.12 MBAdobe PDFView/Open
Sunpetch_so_back.pdf3.02 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.