การเพิ่มผลผลิตของเอนไซม์เพนนิซิลินเอซิเลส โดยการปรับปรุงพลาสมิดดีเอนเอ (pJR69)

Abstract

วัตถุประสงค์ของการวิจัยคือ การหาวิธีเพิ่มความสามารถของการสังเคราะห์เพนนิซิลินเอซีเลส จากแบคทีเรียสายพันธุ์ที่มีพลาสมิดดีเอนเอ pJR69 พลาสมิดดีเอนเอ pJR69 นี้มียีนเพนนิซิลิน เอซีเลสที่ตัดจาก Escherichia coli สายพันธุ์ ATCC 11105 ซึ่งสร้างขึ้นโดย นางสาวจรัญญา เงินประเสริฐดี ในปี 2528 ปัญหาที่เผชิญก็คือ การลดลงของแอคติวิตีของเพนนิซิลิน เอซีเลส ตามจำนวนครั้งของการถ่ายเชื้อที่เพิ่มขึ้น ปรากฏการณ์นี้พบในเซลล์เจ้าเรือนทุกสายพันธุ์ไม่ว่าจะใช้สายพันธุ์ที่มีจีโนไทพ์อย่างไร แต่ความเสถียรของแอคติวิตีของเอนไซม์นี้พบ ในสายพันธุ์ที่เลือกจากทรานสฟอรแมนท์ที่มี พลาสมิดดีเอนเอที่สร้างขึ้นใหม่และให้ชื่อว่า pCR28 ซึ่งมีขนาดน้ำหนักโมเลกุล 5.5 กิโลเบส แต่อย่างไรก็ตาม แอคติวิตีสูงสุดของเพนนิซิลิน เอซีเลสที่พบในสายพันธุ์ดังกล่าวก็ยังมีค่าต่ำ ซึ่งเนื่องมาจากได้สูญเสียสมบัติการเพิ่มจำนวนพลาสมิดดีเอนเอไป ได้แก้ไขให้ความสามารถในการเพิ่มจำนวนชุดของพลาสมิดดีเอนเอกลับคืน โดยการตัดยีนเพนนิซีลีน เอซีเลสจากว่า pCR28 มาต่อเข้ากับพลาสมิดดีเอนเอของ pSY343 ซึ่งตัด เอายีนต้านยาคานามัยซีนออกแล้ว ผลที่ได้คือพลาสมิดดีเอนเอใหม่ที่ให้ชื่อว่า pCR29 ซึ่งมีขนาด 11.5 กิโลเบส หลังจากทรานสฟอร์มพลาสมิดดีเอนเอ pCR29 เข้าสู่เซลล์เจ้าเรือน E.coli BD817 แยกไดัทรานส์ฟอร์แมนท์ชุดหนึ่ง ซึ่งคัดเลือกตัวที่น่าสนใจตัวหนึ่งให้ชื่อว่า W21 เป็นตัวแทนการศึกษาจากการทดลองพบว่า แอคตีวิตีสูงสุดของเพนนิซิลิน เอซีเลส จากสายพันธุ์ W21 มีค่าเท่ากับ 500 นาโนโมล PABA ต่อนาทีมิลลิกรัมโปรตีน ซึ่งเป็นค่าสูงกว่า E.coli ATCC 11105 อยู่ 21 เท่า เมื่อเจริญในสภาวะเดียวกัน เนื่องจาก pCR29 ยังคงสมบัติของการเพิ่มจำนวนพลาสมิดดีเอนเอโดยการเพิ่มอุณหภูมิ จึงทำให้เป็นข้อได้เปรียบในการหาวิธีคัดสายพันธุ์ ซึ่งมีจำนวนพลาสมิดดีเอนเอสูงกว่าโดยหลักการ sibling จากการทดลองได้นำ W21 ผ่านกระบวนการ sibling 2 ครั้ง จึงแยกได้สายพันธุ์ที่ใช้ชื่อว่า X25 และ Y324 และทั้งสองสายพันธุ์นี้มีพลาสมิดดีเอนเอชนิดเดียวกัน แต่ทว่ามีความสามารถต้านยาเพนนิซิลินจีระดับต่างกัน ค่าแอคตีวิตีสูงสุดที่พบในเซลล์ X25 และ Y324 มีค่าเท่ากับ 810 และ 1111 นาโนโมล PABA ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีนตามลำดับ น่าสังเกตว่าค่าแอคติวิตีสูงสุดที่พบใน Y324 มีค่าสูงถึง 48 เท่า เมื่อเทียบกับค่าที่วัดได้จากสายพันธุ์ E.coli ATCC 11105 ในสภาวะเดียวกัน พบว่าการเติมพีนิลอะซีติก เอซิด (PAA) 0.02% และ MgCl2 1 mM ลงในอาหารอุดม นั้นก็เป็นเหตุหนึ่ง ที่ทำให้เกิดการชักนำทางพันธุกรรม และทำให้แอคติวิตีสูงสุดของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซีเลส เพิ่มขึ้น 2 เท่า ในขณะที่การเจริญสูงสุดยังมีค่าไม่ต่างจากก่อนเติมสารดังกล่าว นอกจากนั้นเซลล์ที่ผ่าน starve ในสภาวะที่เหมาะสมอย่างน้อย 4 ชั่วโมง จะพบแอคติวิตีของ เพนนิซิลีน เอซีเลส เพิ่มขึ้นอีก 2 เท่า เช่นกัน ประการสุดท้าย ในการเพิ่มแอคตีวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซีเลส ต่อจำนวนเซลล์ทั้งหมด สามารถทำได้โดย การปรับความขุ่นของคัลเจอร์ หลังเปลี่ยนอุณหภูมิจาก 30 ◦ซ เป็น 37 ◦ ซ ให้ได้ประมาณ 400 KU ก่อนจะเปลี่ยนอุณหภูมิการเจริญกลับมาที่ 30 ◦ซ จะสามารถทำให้ความขุ่นสูงสุด เพิ่มขึ้นจาก 425 KU เป็น 600 KU ทำให้แอคตีวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซีเลส ทั้งหมดเพิ่มขึ้นตามความขุ่นที่เพิ่มขึ้นนี้