การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของกรดไฮยาลูโรนิกจากการหมักด้วยเยื่อแผ่นกรอง

Abstract

งานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาการแยกกรดไฮยาลูโรนิกเพื่อให้มีความบริสุทธิ์เหมาะสมกับการนำไปใช้งานจากน้ำหมัก โดยเลี้ยงเชื้อ Streptococcus zooepidermicus UN-7 เพื่อผลิตกรดไฮยาลูโรนิกในระดับถังหมักขนาด 5 ลิตร ซึ่งได้ความเข้มข้นของกรดไฮยาลูโรนิกในน้ำหนัก 1,995 มิลลิกรัมต่อลิตร เมื่อนำน้ำหมักก่อนแยกเซลล์มาสกัดกรดไฮยาลูโรนิกที่ติดอยู่กับเซลล์โดยใช้โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต พบว่าปริมาณกรดไฮยาลูโรนิกเพิ่มขึ้นเป็น 2,122 มิลลิกรัมต่อลิตร แต่อย่างไรก็ตามขั้นตอนนี้ส่งผลต่อให้น้ำหนักโมเลกุลของกรดไฮยาลูโรนิกลดลง และอาจเพิ่มส่วนประกอบของเซลล์ปนเปื้อนในน้ำหมัก จึงไม่นำวิธีการสกัดกรดไฮยาลูโรนิกด้วยโดเดซิลซัลเฟตมาใช้ ดังนั้นจึงแยกกรดไฮยาลูโรนิกโดยนำน้ำหมักที่แยกเซลล์ออกแล้ว มาตกตะกอนกรดไฮยาลูโรนิกด้วย 95 เปอร์เซ็นต์เอทิลแอลกอฮอล์ โดยใช้เอทิลแอลกอฮอล์ 2 ส่วนต่อน้ำหมัก 1 ส่วน นำตะกอนที่ได้มาละลายในสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.2 โมลาร์ และดูดซับโปรตีนที่ปนเปื้อนด้วยถ่านกัมมันต์ จากนั้นนำไปผ่านกระบวนการอัลทราฟิลเทรชัน โดยใช้เยื่อแผ่นที่มี molecular weight cut off 300,000 ดาลตัน เพื่อจำกัดสารที่มีน้ำหนักโมเลกุลเล็ก เมื่อผ่านกระบวนการข้างต้นพบว่าได้สารละลายกรดไฮยาลูโรนิกที่มีความเข้มข้น 2,100 มิลลิกรัมต่อลิตร น้ำหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 2.1 ถึง 2.3 x 106 ดาลตัน มีความบริสุทธิ์ร้อยละ 83.79 และมีผลผลิตร้อยละ 65.24 ของปริมาณกรดไฮยาลูโรนิกในน้ำหมักเริ่มต้น นอกจากนี้ยังไม่พบการปนเปื้อนโปรตีนจากการวิเคราะห์โดยวิธีลาวรี เมื่อศึกษาปัจจัยทางกายภาพ คือ อุณหภูมิ และ ความเร็วรอบของการกวน และปัจจัยเคมี คือ ค่าความเป็นกรดด่าง และ เอนไซม์ไฮยาลูโรนิเดส ที่มีผลต่อการเปลี่ยนแปลงน้ำหนักโมเลกุลของกรดไฮยาลูโรนิกที่เตรียมได้ พบว่า น้ำหนักโมเลกุลของกรดไฮยาลูโรนิกลดลงประมาณร้อยละ 20 เมื่อบ่มที่อุณหภูมิ 50 70 และ 100 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 0.5 และ 0.08 ชั่วโมง ตามลำดับ เมื่อความเร็วรอบของการกวน 200 และ 400 รอบต่อนาที เป็นเวลา 4 และ 0.5 ชั่วโมง ตามลำดับ เมื่อค่าความเป็นกรดด่างเป็น 1 3 และ 13 เป็นเวลา 0.5 1 และ 0.25 ชั่วโมง ตามลำดับ และเมื่อมีการปนเปื้อนของเอนไซม์ไฮยาลูโรนิเดสเพียง 0.5 ไมโครกรัมต่อมมิลลิลิตร หรือคิดเป็น 0.5 ยูนิตของเอนไซม์ต่อมิลลิลิตร เป็นเวลา 0.10 ชั่วโมง